metode aseptis dalam mikrobiologi

Tanggal Praktikum
Praktikum	1. Metode Aseptis dan Sterilisasi 2. Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroorganisme 3. Pembiakan Mikroorganisme dari Sampel (…..)
Tujuan Praktikum	1. 2. 3.
Kelompok
Nama Anggota	1. 2. 3. 4. 5.

Dasar Teori

·      Metode Aseptis dalam Mikrobiologi

     Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi selama membuat dan mensterilkan medium kultur disebut Teknik Aseptik. Penguasaan teknik ini diperlukan dalam keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi pemula.

     Kontaminan asal udara sering terdapat dalam medium, karena udara selalu mengandung partikel debu tempat komunitas mikroba. Transfer aseptik suatu biakan dari satu tabung medium ke tabung lainnya biasa dilakukan dengan menggunakan jarum inokulasi atau ose yang disterilkan dengan cara membakar di atas api. Biakan juga dapat dipindahkan dari permukaan lempeng agar, sebagai tempat perkembangan koloni dimana sel mengalami pertumbuhan dan pembelahan. Metode utama yang digunakan untuk memperoleh kultur murni dari komunitas mikroba yang mengandung beberapa mikroba yang berbeda dilakukan dengan memilih kolonikoloni yang terpisah dan menggoreskan pada lempeng agar dengan metode gores, sehingga diperoleh koloni mikroba yang murni.

Saran-saran kerja aseptis :

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.

2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar.

3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi.

4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api.

5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya

B. Sterilisasi

B.1 Pengertian dan Tujuan Sterilisasi

Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehide, etilenoksida atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia; oleh sinar lembayung ultra atau sinar gamma. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Curtis, 1999).

B.2 Jenis-Jenis Sterilisasi beserta Prinsip Kerjanya

Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara sterilisasi yang umum digunakan secara rutin di laboratorium Mikrobiologi ialah dengan pemanasan. Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab, bila tanpa kelembaban disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering.

Macam-macam sterilisasi (Machmud, 2008):

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

· Pemanasan

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

· Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.

Sterilisasi dengan panas adalah unit operasi dimana bahan dipanaskan dengan suhu yang cukup tinggi dan waktu yang cukup lama untuk merusak mikrobia dan aktivitas enzim. Sebagai hasilnya, bahan yang disterilkan akan memiliki daya simpan lebih dari enam bulan pada suhu ruang. Contoh proses sterilisasi adalah produk olahan dalam kaleng seperti kornet, sarden dan sebagainya. Perkembangan teknologi prosesing yang memiliki tujuan mengurangi kerusakan nutrien dan konponen sensoris dan juga mengurangi waktu prosesing menjadikan teknik serilisasi terus dikembangkan. Lamanya waktu sterilisasi yang dibutuhkan bahan dipengaruhi oleh: resistensi mikroorganisme dan enzim terhadap panas, kondisi pemanasan, pH bahan, ukuran wadah atau kemasan yang disterilkan, keadaan fisik bahan (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan udara kering, alat yang umum dikenal adalah oven. Alat ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti erlenmeyer, petridish, tabunng reaksi dan alat gelas lainnya. bahan-bahan seperti kapas, kain dan kertas dapat disterilkan dengan alat ini. pada umunhya suhu yang digunakan pada sterilisasi secara kering adalah 170 - 180 C selama palinng sedikit 2 jam. Lama isterilisasi tergantung pada alat dan jumlahnya (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap air panas, bahan yang mengandung cairan tidak dapat didterilkan dengan oven sehingga digunakan alat ini. alat ini disebut Arnold steam sterilizer dengan suhu 1000Cdalam keadaan lembab. Secara sederhana dapat pula digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 1000C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel vegetatif mikrobia. kemudian disimpan pada suhu kamr 24 jam untuk memberi kesempatan spora tumbuh menjadi sel vegetatif, lalu dipanaskan lagi 1000C 30 menit. dan diinkubasi lagi 24 jam dan disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air bertekanan (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap air panas bertekanan, alat ini disebut autoklaf (autoclave) untuk steriliasasi ini alat dilengkapi dengan katup pengaman. Alat diisi dengan air kemudian bahan dimasukkan. Panaskan sampai mendidih dan dari katup pengaman kelaur uap air dengan lancara lalu ditutup. Suhu akan naik sampai 1210C dan biarkan selama 15 menit (untuk industri pengalengan ada perhitungan tersendiri), lalu biarkan dingin sampai tekanan normal dan klep pengaman dibuka, cara ini akan mematikan spora dengan cara penetrasi panas ke dalam sel atau spora sehingga lebih cepat. Cara mana yang dipilih tergantung bahan, biaya dan ketersediaan alat, untuk bahan yang tidak tahan panas, maka cara diatas tidak dapat dipakai (Machmud, 2008).

C. Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroorganisme

C.1 Jenis-Jenis Media Pertumbuhan Mikroorganisme

Penggolongan medium biakan

Berdasarkan sumber karbon yang digunakan, mikroba dibagi menjadi dua kelompok. Mikroba yang mensintesis semua komponen sel dari karbon dioksida dinamakan ototrof , sedangkan mikroba yang memerlukan satu atau lebih senyawa organic sebagai sumber karbon disebut heterotrof .

Berdasarkan sifat keheterotrofannya mikroba dapat digolongkan beberapa kelompok besar medium yakni :

1.      Media hidup

Media hidup pada umumya dipakai dalam Laboratorium Virologi untuk pembiakan berbagai virus, sedangkan dalam Laboratorium Bakteriologi hanya beberapa kuman tertentu saja, dan terutama pada hewan percobaan. Contoh media hidup adalah : hewan percobaan (termasuk manusia), telur berembrio, biakan jaringan, dan sel-sel biakan bakteri tertentu untuk penelitian bakteriofaga (bakteri yang terinfeksi oleh virus)

2.   Media mati

Pada media mati juga dikenal adanya media sintesis. Media sintesis merupakan media yang mempunyai kandungan dan isi bahan yang telah diketahui secara terperinci. Media sintesis sering digunakan untuk mempelajari sifat faali dan genetika mikroorganisme. Senyawa anorganik dan senyawa organic ditambahkan dalam media sintetik harus murni. Dengan demikian media sintetik harganya cukup mahal. Contoh media sintetik, antara lain cairan Hanks, Locke, Thyrode, Eagle.

Penggolongan media mati berdasarkan konsistensinya

1.Media padat

2.Media setengah padat (semi solid medium)

3.Media cair

Penggolongan media mati berdasarkan susunan kimianya

1.Medium non sintetik

2.Medium sintetik

3.Medium semi sintetik

4.Medium anorganik

5.Media organic

Penggolongan media mati berdasarkan fungsinya

1.Medium selektif/elektif

2.Medium difernsial

3.Medium ekslusif

4.Medium penguji/esei

5.Medium diperkaya (Enriched Medium)

6.Medium khusus

7.Medium persemaian (Nutrient Media)

8.Medium serbaguna 

C.2 Prinsip Kerja Pembuatan Media dan Perhitungannya

1.      Cara pembuatan medium biakan

a.                   Mencampur bahan-bahan

Bahan-bahan yang diperlukan dilarutkan dalam air suling, kemudian dipanaskan dalam pemanas air supaya larutannya homogen.

b.                  Menyaring

Beberapa jenis medium kadang-kadang perlu disaring. Alat yang digunakan untuk menyaring adalah kertas saring, kapas, atau kain. Khusus medium gelatin atau agar penyaringannya harus dilalukakan dalam kedaan panas.

c.                   Menentukan dan mengatur pH

Penentuan pH medium dapat dilakukan dengan menggunakan kertas pH, pH meter atau dengan komparator blok. Pengaturan pH medium dapat dilakukan dengan penambahan asam atau basa (organic atau anorganik) 

d.                  Memasukkan medium ke wadah tertentu

Sebelum disterilkan, medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi, Erlenmeyer, atau wadah bersih lainnya. Kemudian medium ditutup kapas dan dibungkus kertas sampul coklat atau lainnya supaya tidak basah sewaktu disterilkan.

e.                   Sterilisasi 

Pada umumnya sterilisasi medium dilakukan dengan uap panas di dalam otoklaf, pada suhu 121° C selama 15-20 menit

C. Cara pembuatan medium biakan

Standar bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan medium adalah :

----------------------------------------------------------------------------

Jenis jenis pelarutaan pengencer

-----------------------------------

D. Perkembangbiakan organism dari sampel (puyer)

 D.1 tinjauan tentang sampel

-----------------------

D.2 Macam-Macam Metode yang digunakan untuk Pembiakan Mikroorganisme

----------------------------------

Alat dan Bahan

-------------------------

Prosedur Kerja

A. Prosedur Metode Aseptis

1. Pada meja tempat melakukan analisa mikrobiologi disemprot dengan alkohol 70%

2. Pada telapak tangan praktikan disemprot alkohol 70%

3. Disiapkan pemanas spirtus dan korek api

B. Prosedur Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroorganisme

C. Prosedur Sterilisasi dengan Autoclave

1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.

2. Bungkus alat yang akan di sterilisasi dengan kertas coklat.

3. Letakkan secara teratur ke dalam autoclave.

4. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf.

5. Nyalakan autoklaf.

6. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman sehingga menghasilkan bunyi mendesis. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan).

7. Tunggu selama beberapa 15 menit

D. Preparasi Sampel Puyer

--------------

----------------

E. Prosedur Penanaman dan Pembiakan Mikroorganisme

--------------

-------------

Daftar Pustaka

Hadioetomo, Ratna S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama

Waluyo, Lud. 2010. Teknik Metode Dasar Mikrobiologi. Malang: Universitas Muhammadiyah Malang

Faridz, Raden. Hafiluddin. Anshari, Mega. 2007. Analisis Jumlah Bakteri dan Keberadaan Eschericia coli pada Pengolahan Ikan Teri Nasi di PT. Kelola Mina Laut Unit Sumenep. ISSN 0216-0188.

Curtis, Helena, Barnes, N. Sue. 1999. Biology 5th edition. Worth Publisher Inc. New York

Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.

Nurohaianah et al, 2007. Media . Jakarta : UI Press.